Ciri -ciri Proteinase K, Aktiviti Enzimatik, Aplikasi

The Proteina k Ia adalah enzim yang dimiliki oleh kumpulan protease serine, iaitu, ia mempunyai pusat pemangkin aktifnya sebagai asid amino serine dan mempunyai fungsi memecahkan ikatan peptida oleh hidrolisis. Sebaliknya, enzim ini tergolong dalam keluarga protein subtilisin (Peptidase S8).

Proteinase K mempunyai berat molekul (PM) sebanyak 28.900 Daltons dan pertama kali terpencil dalam 1.974 dalam ekstrak kulat Album Engyodontium, sebelum ini dikenali sebagai nama Tritirachium Album Limber.

Struktur molekul proteine ​​k. Sumber: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/lesen/by-sa/4.0)]

Ia membentangkan kapasiti proteolitik yang tinggi, ditunjukkan dengan dapat merendahkan keratin yang ada di rambut. Perkataan keratin dalam bahasa Inggeris ditulis "keratin", dari sana ia datang bahawa ia telah dipanggil "proteinsa k".

Kerana kuasa tinggi untuk memecah protein asli, enzim ini berguna dalam pelbagai teknik biologi molekul. Terutamanya digunakan untuk melindungi dan menyediakan asid nukleik dengan berat molekul yang tinggi (PM).

Proteinase K bertindak dengan melepaskan DNA nuklear, sambil memusnahkan protein dan tidak aktif kepada RNase dan DNate, iaitu, menghapuskan nukleus dalam persiapan DNA dan RNA.

Sebaliknya, telah dilihat bahawa proteinase k boleh menghidrolisis beberapa protein asli yang denatured, yang telah menjadikan kepentingan penyelidik untuk digunakan dalam kajian protein prion (PRPC).

Walau bagaimanapun, walaupun kuasa proteolitik yang tinggi terdapat protein yang tahan terhadap tindakan protein k. Antaranya, terdapat beberapa protein anomali yang dipanggil prion (PRPSC), yang dikaitkan dengan encephalopathies spongiform yang boleh ditularkan.

[TOC]

Ciri -ciri proteinase k

Proteinase K mempunyai struktur tertiari yang terdiri daripada tiga lapisan, dengan lembaran β tujuh rantai perubatan antara dua lapisan kipas. Kerana kepunyaan keluarga peptidase S8 dicirikan dengan membentangkan triad pemangkin di tapak aktifnya, yang urutan berurutan adalah (ASP, dia dan menjadi), yang membezakannya dari keluarga peptidase yang lain.

Ia dapat melayani anda: asid amino protein

Enzim kumpulan protease serine ini dicirikan oleh hidrolisis ikatan peptida yang dekat dengan kumpulan karboksilik asid amino alifatik dan aromatik.

Sebaliknya, ia dapat bertindak dengan kehadiran bahan-bahan yang menghakis tertentu, seperti natrium dodecilsulfate (SDS), tris-hcl dan edta, yang digunakan untuk membantu denaturasi protein, menyebabkan mereka kehilangan struktur asli mereka.

Ini adalah langkah sebelumnya dalam penyediaan protein untuk teknik elektroforesis. Julat pH yang mana tindakan k protein agak luas (2.0 hingga 12.0), dengan pH yang optimum antara 7.5 hingga 12.0, dan titik isoelektriknya ialah 8.9. Seperti yang dapat dilihat, ia aktif terhadap pelbagai pH yang sangat luas.

Ciri lain yang menonjol dalam proteine ​​k adalah kestabilannya dengan kehadiran suhu tinggi (50 - 60 ° C).

Aktiviti enzimatik

Proteinsa K memerlukan kehadiran kalsium ion, walaupun ia tidak menjejaskan aktivitinya, jika penting untuk mengekalkan kestabilannya.

Bagi proteinsa K untuk melaksanakan pencernaan lengkap substrat, masa hubungan anggaran diperlukan antara 5 minit sehingga 2 jam.

Walau bagaimanapun, dalam erti kata ini Daza dan kolaborator membandingkan kesucian DNA yang diperoleh pada beberapa masa pendedahan terhadap proteinase K, dan menyimpulkan bahawa inkubasi yang berpanjangan (sehingga 24 jam) meningkatkan kualiti DNA.

Sekarang, berhubung dengan kepekatan yang digunakan enzim proteinase k dalam protokol yang berbeza, dapat dikatakan bahawa ia sangat bervariasi.

Ia boleh digunakan dari kepekatan yang sangat rendah (5 μg/ml) hingga 500 μg/ml kepekatan. Tetapi kepekatan kerja yang paling kerap berkisar antara 50-100μg /ml, terutamanya untuk pencernaan dan nukleus protein. Walaupun untuk rawatan tisu kepekatan 2 mg/ml diperlukan.

Boleh melayani anda: Easmotherium Sibiricum: Ciri -ciri, Habitat, Fosil

Aplikasi

Aplikasi mereka sangat luas dan boleh diringkaskan dalam perkara berikut:

-Ia digunakan dalam pencernaan protein dan pengekstrakan DNA oleh beberapa kaedah seperti: salting-out, pk-sds, cethyl-tritetyl ammonium (CTAB), diubahsuai kalium asetat dan natrium iodida pengekstrakan asetat asetat asetat.

-Inaktivasi nukleas (RNASA dan DNASA).

-Dalam teknik hibridisasi In situ (Dia), untuk membantu pembebasan asid nukleik, selain menghapuskan protein yang tidak diingini.

-Pengubahsuaian protein.

-Di peringkat penyelidikan, dalam pelbagai kajian.

Kelebihan K Proteinase

Pelbagai kajian perbandingan telah dijalankan antara teknik pengekstrakan DNA yang menggunakan proteinase k, dengan orang lain yang tidak menggunakannya dan semua menyimpulkan bahawa terdapat manfaat yang lebih besar apabila enzim digunakan. Antara kelebihan, perkara berikut boleh disebutkan:

-DNA molekul tinggi, berkualiti tinggi dan kesucian diperolehi.

-DNA yang diekstrak stabil sehingga 3 bulan.

DNA yang diekstrak boleh digunakan dalam teknik berikut: Blot Selatan, tindak balas rantai polimerase (PCR), elektroforesis, antara lain.

Protein proteinase K

Pelbagai penyiasatan telah membuat kesimpulan bahawa prion (protein anomali prpsc toksik berbeza daripada protein PRPC (asli) dengan tahan terhadap tindakan proteinase K, manakala PRPCs sensitif terhadap tindakan mereka.

Penulis lain telah menyatakan bahawa dalam struktur PRPSC terdapat bahagian sensitif dan yang lain tahan terhadap proteinase K. Walau bagaimanapun, kedua -dua pihak adalah sama toksik dan berjangkit.

Sebaliknya, Bastian dan kolaborator pada tahun 1987 mengasingkan 4 protein 28, 30, 66 dan 76 kDa dari sejenis Spiroplasma Mirum. Semua ternyata tahan terhadap tindakan proteinase k dan juga mempunyai reaksi silang dengan beberapa prion.

Boleh melayani anda: chemotoxis

Telah diketahui bahawa spesies ini boleh menyebabkan katarak penting dan kerosakan neurologi dan disebabkan oleh penemuan saintifik Bastian, antara penyelidikan lain, ia telah cuba mengaitkan dengan mikroorganisma ini dengan encephalopathies spongiform yang boleh ditransmisikan.

Walau bagaimanapun, etiologi patologi neurologi degeneratif ini masih dikaitkan dengan prion.

Dalam pengertian ini, Butler dan kolaborator pada tahun 1991 mengenal pasti dan mencirikan kelas proteinase 40 kDa kda -yang diperoleh dari dua strain dari dua strain dari dua strain Mycoplasma hyorhinis. Patogen ini mempengaruhi babi, menjangkiti tisu mereka, tetapi dalam kes ini tidak ada reaksi silang dengan penjara yang diuji.

Lebih banyak penyelidikan diperlukan untuk menjelaskan banyak yang tidak diketahui dalam hal ini.

Rujukan

1. Bastian F, Jennings R, dan Gardner W. 1987. Antiserum ke protein fibril yang berkaitan dengan scrapie silang dengan Spiroplasma Mirum Protein fibril. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Penilaian kaedah pengekstrakan dan pembersihan DNA dari tisu otot yang ditetapkan dalam formaldehid mayat yang tidak dikenali.  Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, dan McGarrity G. Pengenalpastian dan pencirian protein protein K-tahan pada ahli-ahli molis kelas.  Jangkitan dan Imuniti, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Maghocoima A, Herrera L, et al. Perbandingan dua protokol pengekstrakan DNA Trypanosoma cruzi ditanam dalam medium axhenic. REV. Peru. Med. Exp. Kesihatan Awam  2014; 31 (2): 222-227. Terdapat di: Scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E dan Palma W. Penentuan Keberkesanan Lima Protokol Pengekstrakan DNA Dari Bahan Parafined untuk Kajian Molekul. Rev Méd Medic Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.