DNA rekombinan teknikal, aplikasi dan asas

Dia DNA rekombinan (DNA atau rDNA) adalah molekul asid nukleik buatan yang dibuat di makmal, dengan mengintegrasikan dua segmen organisma yang menarik. Ia juga dikenali sebagai DNA Chimeric, terima kasih kepada harta hibridnya. Kami tidak menemui jenis DNA ini.

Metodologi asas untuk menghasilkannya termasuk: (a) pemilihan DNA putih, dan penyisipannya dalam serpihan DNA yang lain (umumnya plasmid bakteria); (b) Pengenalan plasmid ini dalam bakteria, (c) pemilihan bakteria melalui antibiotik dan akhirnya (d) ungkapan gen.

Sumber: Pixabay.com

Teknik ini mengambil kesempatan daripada permainan enzim yang membolehkan anda menyalin dan menyisipkan serpihan DNA tertentu ke percubaan penyelidik.

Objektif teknologi rekombinan adalah, dalam kebanyakan kes, ekspresi protein (dikenali sebagai protein rekombinan) yang dikehendaki oleh ahli biologi molekul untuk penyiasatan masa depan atau untuk mewujudkan protein nilai komersial dan terapeutik - seperti insulin manusia, misalnya, misalnya.

[TOC]

Asas teknik DNA rekombinan dan penggunaannya dalam kejuruteraan genetik

Dogma pusat biologi molekul

Semua makhluk organik yang kita tahu berkongsi beberapa ciri. Salah satu daripada mereka adalah sifat bahan genetik dan cara protein dihasilkan - proses yang dikenali sebagai "dogma" pusat biologi molekul.

Dengan pengecualian sepasang virus, semua organisma menyimpan maklumat genetik dalam DNA (asid deoxyribonucleic), dikumpulkan sangat padat dan dianjurkan dalam nukleus sel.

Untuk ekspresi gen, molekul DNA disalin ke RNA messenger, dan yang terakhir diterjemahkan ke dalam bahasa asid amino, blok struktur protein.

Apakah DNA rekombinan?

Antara tahun 70 -an dan 80 -an, ahli biologi molekul mula memanfaatkan proses yang secara semula jadi berlaku di dalam sel dan berjaya mengekstrapolasi mereka ke makmal.

Dengan cara ini, gen haiwan (vertebrata, misalnya) boleh dimasukkan ke dalam segmen DNA dari bakteria; atau DNA bakteria boleh digabungkan dengan DNA virus. Oleh itu, kita boleh menentukan DNA rekombinan sebagai molekul yang terdiri daripada DNA dari dua organisma yang berbeza.

Sebaik sahaja molekul hibrid atau rekombinan ini telah dibuat, kami meneruskan ekspresi gen minat. Dengan perkataan ungkapan Kami mahu merujuk kepada proses terjemahan protein.

Boleh melayani anda: monohíbrid

Enzim Sekatan dan Liga: Kunci proses

Unsur utama untuk membangunkan teknologi DNA rekombinan adalah penemuan enzim sekatan.

Ini adalah molekul protein yang mempamerkan keupayaan untuk berpecah kepada DNA (nukleus) dalam urutan konkrit, berfungsi sebagai "gunting molekul". Serpihan yang dihasilkan oleh enzim ini dipanggil serpihan sekatan.

Enzim -enzim ini boleh dihasilkan dalam urutan putih pemotongan simetri (dalam kedua -dua rantai pada ketinggian yang sama) atau pemotongan asimetrik. Aspek utama tindakan enzim sekatan adalah bahawa selepas pemisahan rantai "kelebihan longgar" diperoleh, pelengkap ke kelebihan lain yang dipotong oleh enzim yang sama.

Beberapa contoh adalah Ecor 1 dan SMA 1. Lebih daripada 200 jenis enzim sekatan kini diketahui dan mereka tersedia secara komersil.

Untuk berguna, gunting mesti disertakan dengan gam. Tindakan pengedap DNA ini (sebelum ini dirawat dengan enzim sekatan) dijalankan oleh liga.

Teknik: Bagaimana DNA organisma di makmal diubahsuai secara buatan?

Seterusnya kami akan menerangkan langkah utama yang diperlukan oleh teknologi DNA rekombinan. Semua dijalankan oleh profesional di makmal biologi molekul.

Apa itu "klon"?

Sebelum meneruskan dengan protokol eksperimen, kita harus melihat bahawa dalam Biologi dan Bioteknologi Molekul Istilah "klon" dan kata kerja "Clonar" digunakan secara meluas. Ini boleh menyebabkan kekeliruan.

Dalam konteks ini, kita tidak merujuk kepada pengklonan semua Sebuah organisma (seperti dalam kes domba dolly yang terkenal, misalnya), tetapi untuk pengklonan serpihan DNA, yang boleh menjadi gen. Iaitu, menghasilkan banyak salinan - identik genetik - dari urutan.

1. Pengasingan dan mendapatkan DNA

Langkah pertama adalah untuk menentukan urutan mana yang ingin digunakan. Ini bergantung sepenuhnya kepada penyelidik dan objektif karyanya. Kemudian, DNA ini mesti diasingkan dan disucikan. Kaedah dan prosedur untuk mencapai ini bergantung kepada organisma dan tisu.

Sebahagian tisu biasanya diambil dan menjalani rawatan dalam penggemar lisis. Selanjutnya, pemecahan bahan genetik dalam serpihan kecil diteruskan.

2. Pengklonan vektor

Selepas langkah persediaan, penyelidik berusaha memperkenalkan segmen DNA yang menarik dalam vektor pengklonan. Mulai sekarang ke segmen DNA ini kita akan menyebutnya DNA putih.

Ia boleh melayani anda: gen dominan: prinsip genetik, kaedah pengajian, faktor

Plasmids

Salah satu vektor yang paling banyak digunakan dalam plasmid asal bakteria. Plasmid adalah molekul DNA bulat dua kali ganda yang kita dapati secara semula jadi dalam bakteria. Mereka adalah entiti di luar kromosom bakteria - iaitu, mereka adalah extracromosomal, dan secara semula jadi dijumpai dalam prokariot ini.

Unsur -unsur asas vektor adalah: (a) asal replikasi, yang membolehkan sintesis DNA; (b) ejen pemilihan, yang membolehkan mengenal pasti organisma yang membawa plasmid dengan DNA putih, seperti penentangan terhadap antibiotik; dan (c) tapak multiclonasi, di mana urutan yang akan diiktiraf oleh enzim sekatan dijumpai.

DNA rekombinan pertama yang berjaya di makmal telah diklonkan di plasmid PSC101 dari bakteria Dan. coli. Ini mengandungi tapak sekatan untuk enzim sekatan ECORI dan gen rintangan kepada antibiotik, sebagai tambahan kepada asal replikasi.

Penyisipan DNA putih dalam plasmid dilakukan menggunakan alat molekul enzim dan liga sekatan yang diterangkan dalam bahagian sebelumnya.

Jenis vektor substansi

Sebagai tambahan kepada plasmid, DNA boleh dimasukkan ke dalam vektor lain, seperti bacteriophage lambda.

3. Pengenalan DNA rekombinan

Sebaik sahaja molekul DNA rekombinan (gen yang menarik dalam plasmid atau vektor lain) telah diperolehi.

Untuk memperkenalkan DNA asing dalam bakteria, teknik yang dipanggil transformasi bakteria digunakan, di mana badan diserahkan kepada rawatan dengan kation divalen yang menjadikannya terdedah kepada pengambilan DNA.

Secara metodologi, kami tidak dapat memastikan bahawa 100% bakteria dalam tanaman kami telah mengambil molekul DNA rekombinan kami. Di sinilah bahagian plasmid yang mengandungi rintangan antibiotik dimainkan.

Oleh itu, bakteria yang telah mengambil plasmid akan tahan terhadap antibiotik tertentu. Untuk memilihnya, ia akan mencukupi untuk permohonan antibiotik tersebut dan mengambil mangsa yang terselamat.

4. Protein "Harvest"

Selepas memilih bakteria dengan DNA rekombinan kami, kami terus menggunakan jentera enzimatik tuan rumah untuk menghasilkan produk protein yang menarik. Apabila bakteria diterbitkan semula, plasmid berlalu ke anaknya, jadi tidak hilang semasa pembahagian.

Prosedur ini menggunakan bakteria sebagai sejenis "kilang" protein. Kemudian kita akan melihat bahawa ia telah menjadi prosedur yang sangat relevan dalam pembangunan rawatan perubatan yang berkesan.

Boleh melayani anda: Telophase: Apa, dalam mitosis, dalam meiosis

Setelah tanaman siap dan bakteria telah menghasilkan sejumlah besar protein, sel atau pecah sel adalah. Terdapat pelbagai teknik biokimia yang membolehkan pemurnian protein mengikut ciri-ciri fizikal mereka.

Dalam konteks eksperimen lain, kami mungkin tidak berminat untuk menghasilkan protein, tetapi kami berminat untuk mendapatkan urutan DNA per se. Sekiranya berlaku, plasmid akan berfungsi untuk mewujudkan pelbagai salinan serpihan yang menarik minat kita dengan tujuan mempunyai kuantiti yang mencukupi DNA putih untuk melaksanakan eksperimen yang relevan.

Aplikasi

Teknologi DNA rekombinan membuka bilangan kemungkinan yang tidak terhingga untuk biologi molekul, bioteknologi, perubatan dan kawasan lain yang berkaitan. Aplikasi paling cemerlang anda adalah yang berikut.

Analisis genetik

Permohonan pertama berkaitan secara langsung dengan makmal biologi molekul. Teknologi DNA rekombinan membolehkan para penyelidik memahami fungsi normal gen, dan protein yang dihasilkan dapat digunakan dalam penyelidikan berikutnya.

Industri farmaseutikal

Protein yang dihasilkan menggunakan prosedur DNA rekombinan mempunyai aplikasi dalam bidang perubatan. Dua contoh yang sangat relevan di lapangan adalah insulin manusia dan hormon pertumbuhan, yang digunakan pada pesakit yang tidak mempunyai protein sedemikian.

Terima kasih kepada DNA rekombinan, protein ini dapat dihasilkan tanpa perlu mengekstrak dari manusia lain, yang mewakili komplikasi metodologi tambahan dan risiko kesihatan. Ini telah membantu meningkatkan kualiti hidup pesakit yang tidak terhitung jumlahnya.

Rujukan

1. BACA, l. Dan. L., & Álvarez, c. L. C. (2015). Biologi 2. Kumpulan Editorial Patria.
2. Cooper, g. M., Hausman, r. Dan., & Hausman, r. Dan. (2000). Sel: pendekatan molekul (Vol. 10). Washington, DC: ASM Press.
3. Devlin, t. M. (2004). Biokimia: Buku teks dengan aplikasi klinikal. Saya terbalik.
4. Khan, s., Ullah, m. W., Siddique, r., Nabi, g., MANAN, s., Yousaf, m., & Hou, h. (2016). Peranan teknologi DNA rekombinan untuk meningkatkan kehidupan. Jurnal Antarabangsa Genomik, 2016, 2405954.
5. Mindan, f. P., & Mindan, p. (Sembilan belas sembilan puluh enam). Anatomi patologi. Elsevier Sepanyol.
6. Tortora, g. J., Funke, b. R., & Kes, c. L. (2007). Pengenalan kepada Mikrobiologi. Ed. Pan -American Medical.
7. Mereka. J. (1989). Insulin Manusia: Ubat pertama teknologi DNA. American Journal of Health-System Pharmacy, 46(11_suppl), S9-S11.