Kaedah Bradford Apa, Prinsip, Reagen, Kegunaan

Dia Kaedah Bradford Ini adalah kaedah kolorimetrik yang kini digunakan untuk anggaran pesat jumlah kepekatan protein dalam sampel percubaan biologi. Ia digunakan dalam pelbagai bidang penyelidikan biologi, perubatan, veterinar, agronomi, dll.

Ia dikenali sebagai "Kaedah Bradford" kerana ia mula -mula digambarkan oleh Marion Bradford pada tahun 1976, dalam penerbitannya yang berjudul Kaedah yang cepat dan sensitif untuk kuantifikasi protein dalam jumlah mikrogram menggunakan prinsip protein-youth kesatuan.

Gambar plak ELISA di mana sampel telah disediakan untuk kuantifikasi Bradford (Sumber: Helito, CC BY-SA 4.0, melalui Wikimedia Commons)

Sejak cadangannya, kaedah ini telah dipopularkan secara umum, kerana ia diiktiraf lebih sensitif daripada kaedah kuantifikasi protein lain (seperti Lowry dan Biuret, misalnya); bentuk kompleks yang lebih stabil dan mudah dilaksanakan.

Di samping itu, telah ditunjukkan bahawa reagen yang mereka gunakan mempunyai sedikit gangguan dalam pengukuran spektrofotometrik dalam keadaan yang berbeza.

[TOC]

Prinsip kaedah

Kaedah Bradford didasarkan pada kuantifikasi perubahan warna dalam penyelesaian kerana kesatuan - dalam keadaan berasid - molekul protein sampel dengan molekul pewarna khas: Coomassie Blue Biru cemerlang G250.

Apabila pewarna ini ditambah kepada larutan protein, ia mengikat molekul ini melalui daya elektrostatik dan tindak balas ini dibuktikan sebagai warna coklat kemerahan berubah menjadi biru ke biru.

Protein dan asid amino

Sama seperti badan dibentuk oleh banyak sel dan asid nukleik (seperti DNA dan RNA) dibentuk oleh nukleotida, protein dibentuk oleh urutan yang diperintahkan beberapa molekul yang dikenali sebagai asid amino.

Asid amino adalah molekul yang terdiri daripada atom karbon pusat yang mana 4 kumpulan kimia yang berlainan disatukan: atom hidrogen, kumpulan karboksil, kumpulan amino dan rantaian atau rantaian sampingan, yang memberikan identiti.

Terdapat 20 asid amino yang biasa bagi semua protein, yang berbeza antara satu sama lain berkenaan dengan sifat -sifat kumpulan sampingan mereka: terdapat asid amino asas, asid, kutub, apolar, kitaran, aromatik, dan lain -lain.

Boleh melayani anda: Undang -undang Toleransi Shelford: Apakah dan Contohnya

Jumlah ciri -ciri asid amino ini dan urutan di mana mereka bergabung untuk membentuk struktur protein memberikan setiap protein satu siri ciri -ciri fizikokimia tertentu, sama ada mengenai beban mereka, jisim mereka, hidrofobisiti mereka, antara lain.

Kompleks Tint-Protein

Kaedah Bradford, kemudian mengukur kehadiran sisa asid amino ciri -ciri asas dalam sampel biologi, terutamanya asid amino seperti arginin, lisin dan histidin, yang merupakan yang lebih mudah ditampung dengan coomassie biru.

Perubahan warna diukur sebagai variasi dalam penyerapan sampel, yang diukur menggunakan spektrofotometer yang diselaraskan kepada panjang gelombang 595 nm.

Apa itu penyerapan?

Ia juga dikenali sebagai ketumpatan optik dan mentakrifkan jumlah cahaya yang diserap oleh penyelesaian. Penyerapan ini bergantung pada panjang gelombang cahaya yang digunakan untuk menyinari penyelesaian, kerana tidak semua molekul dapat menyerap panjang gelombang yang sama.

Fenomena ini diringkaskan dalam undang-undang yang dikenali sebagai Undang-undang Beer-Lambert, yang mewujudkan hubungan antara penurunan jumlah cahaya yang melalui bahan dan sifat bahan tersebut.

Sebagai contoh, apabila cahaya dihantar melalui penyelesaian, terdapat dua langkah intensiti: intensiti insiden (sebelum menyeberangi larutan) dan intensiti yang dihantar (umumnya lebih rendah, yang sepadan dengan pecahan cahaya yang tidak diserap oleh penyelesaiannya).

Hubungan antara kedua -dua nilai adalah apa yang dikenali sebagai pemprosesan dan mempunyai nilai antara 0 dan 1 atau dinyatakan dalam istilah peratusan.

Penyerapan berkaitan dengan pemprosesan cara logaritma, dan undang-undang Beer-Lambert mencadangkan hubungan linear antara penyerapan penyelesaian dan kepekatannya, pekali kepupusan molar dan pekali optik penyelesaian; Persamaan matematik yang menggambarkan undang -undang ini adalah seperti berikut:

Boleh melayani anda: fauna berbahaya: penyebab percambahan, akibat, kawalan

A (penyerapan) = ε (pekali kepupusan molar) C (kepekatan) l (panjang lulus cahaya)

Kepekatan penyelesaian dikira dengan penjelasan mengatakan tidak diketahui persamaan dan melaksanakan pengiraan yang relevan (c = a/εl)

Apa itu spektrofotometer?

Ia adalah peranti yang digunakan untuk mengukur jumlah cahaya (bergantung pada panjang gelombang) yang menyerap molekul dalam larutan atau, dengan kata lain, jumlah cahaya yang mereka lalui.

Spectrophotometer berfungsi dengan memancarkan sinar cahaya (kelihatan atau ultraviolet) yang melalui prisma (atau peranti yang dikenali sebagai monochromator rangkaian difraksi) yang memecahkannya dalam panjang gelombang yang berbeza yang membuatnya, membolehkan "memilih" panjang tertentu.

Cahaya ini diluluskan melalui tiub khas yang mengandungi sampel yang dianalisis dan seterusnya mencapai pengesan yang melihat jumlah cahaya yang dihantar dari sampel tersebut (yang tidak diserap) yang dapat diperhatikan kemudian terima kasih kepada "penterjemah" itu mempunyai antara muka grafik.

Pewarna: Coomassie Blue Biru cemerlang G 250

Reagen yang paling penting dalam kaedah ini adalah, tanpa keraguan, pewarna yang digunakan untuk "menandakan" protein dalam sampel. Bradford mencadangkan tugasnya kerana pewarna ini wujud dalam dua cara: satu merah dan satu biru. Bentuk merah menjadi bentuk biru apabila pewarna mengikat kepada protein, membentuk kompleks.

Kompleks biru protein biru mempunyai pekali kepupusan molar yang sangat tinggi, menghasilkan kepekaan yang lebih besar untuk kuantifikasi kepekatan protein dalam sampel yang dianalisis.

Reagen

Walaupun penyelesaian yang digunakan untuk kaedah kuantifikasi ini biasanya dipasarkan dalam bekas tertutup, sudah disediakan -"Bradford Reactive" -, reagen utama yang digunakan adalah:

- Coomassie Blue Biru cemerlang G50 (0.01% w/v)

- Asid fosforik (8.5 % w/v)

- Ethanol (4.7% w/v)

Kit Kuantifikasi Protein oleh Kaedah Bradford (Sumber: Vivo Rolfe, CC By-SA 4.0, melalui Wikimedia Commons)

Seperti dalam mana -mana kaedah dan protokol kuantiti protein dengan kaedah spektrofotometrik, perlu mempunyai protein "standard" atau "standard" untuk melakukan a lengkung penentukuran untuk menentukan nilai penyerapan yang berkaitan dengan kepekatan protein yang berbeza; Umumnya albumin serum lembu digunakan.

Boleh melayani anda: Coklat agar

Kaedah ini terdiri daripada mencampurkan jumlah sampel tertentu masalah dengan jumlah tertentu reagen Bradford; Tunggu beberapa minit untuk interaksi pewarna protein dan perubahan warna jelas dan kemudian diukur dan merekodkan nilai penyerapan untuk melakukan pengiraan berikutnya.

Penggunaan/aplikasi

Kaedah Bradford adalah salah satu kaedah kuantifikasi atau anggaran kepekatan protein yang paling banyak digunakan di dunia, terutamanya disebabkan oleh kos yang rendah, dengan kelajuan yang diperolehi, kepada kestabilan yang besar antara protein dan pewarna yang digunakan, untuk kebolehulangannya dan gangguan minimum bahawa komponen reagen yang digunakan semasa pengukuran mempunyai.

Kaedah ini digunakan dalam beratus -ratus aplikasi saintifik yang berbeza untuk penentuan protein dalam konteks yang berbeza: fisiologi, sitologi, imunologi, klinikal, perindustrian (terutamanya dalam industri makanan), dll.

Secara eksperimen, kaedah ini sangat berguna untuk:

• Pantau jumlah protein yang terkandung dalam jumlah yang diperolehi secara progresif dari lajur kromatografi (dalam lajur afiniti, pertukaran ion, penyerapan, penapisan gel, antara lain) i.dan. Menganalisis pecahan protokol pemurnian protein.
• Pantau jumlah protein yang dimuatkan dalam gel untuk elektroforesis.
• Anggarkan jumlah protein yang diperolehi dalam sistem overexpression.

Rujukan

1. Bonjoch, n. P., & Tamayo, p. R. (2001). Kuantiti Kandungan Protein oleh Kaedah Bradford. Dalam Buku Panduan Teknik Ecophysiology Plant (PP. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, m. M. (1976). Kaedah yang cepat dan sensitif untuk kuantiti kuantiti mikrogram protein menggunakan pengikatan protein utama. Biokimia Analisis, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, c. L., Bauer, w., & Urbatsch, i. L. (2020). Assay Bradford untuk menentukan kepekatan protein. Protokol Cold Spring Harbour, 2020 (4), PDB-PROT102269.
4. Sapan, c. V., Lundblad, r. L., & Harga, n. C. (1999). Teknik ujian protein colorimetrik. Bioteknologi dan Biokimia Gunaan, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Ed.). (Sembilan belas sembilan puluh enam). Buku Panduan Protein Protein (Vol. Sembilan belas sembilan puluh enam). Media Sains & Perniagaan Springer.