Asas ujian oksidase, prosedur dan kegunaan

The Ujian Oxidase Ia adalah kaedah diagnostik yang menunjukkan kehadiran kompleks enzimatik yang dipanggil cytochrome oxidase c. Sistem ini mendorong transformasi dikurangkan kepada cytochrome teroksida, kerana ia menangkap oksigen dan ini seterusnya bertindak sebagai penerima elektron terakhir (h⁺) Dalam rantai pernafasan.

Istilah oksidase adalah cara ringkasan merujuk kepada enzim oksidase sitokrom, juga dikenali sebagai indefenol oksidase. Pada zaman purba ia dipercayai bahawa enzim oksidase cytochrome dan indeophenol oxidase adalah dua enzim yang berbeza, tetapi hari ini diketahui bahawa mereka adalah sama.

Ujian oksidase positif dan negatif. Sumber: Tiada pengarang yang boleh dibaca mesin yang disediakan. Alpha.Prim ~ commonswiki diasumsikan (berdasarkan tuntutan hak cipta). [Domain awam]

Bagi bahagian mereka, sitokrom adalah hemoprotein yang mengandungi besi dan melengkapkan sistem oksidase sitokrom. Cytochromes boleh berbeza dari satu spesies ke spesies yang lain.

Terdapat pelbagai jenis cytochromes (cytochromes a1, a2, a3 dan 0). Sesetengah bakteria boleh menghasilkan hanya satu, tetapi yang lain sehingga dua atau tiga pada masa yang sama. Dalam pengertian ini, kehadiran cytochrome a dan a3 dikenali sebagai sitokrom - oksidase c. Ini adalah jenis sitokrom yang mengesan ujian oksidase.

Genre neisseria dan pseudomonas mengandungi oksidase c sitokrom. Genre ini memberikan ujian oksidase positif, membantu membezakannya dari genre Acinetobacter dan Stenotrophomonas masing -masing.

Terdapat juga genre lain yang positif oksidase.

[TOC]

Asas

Ciri -ciri Sistem Oxidase Cytochrome C

Sistem Cychocroma Oxidase C bertindak seperti berikut: Mikroorganisma oksidase positif menggunakan oksigen untuk menjana tenaga melalui pernafasan aerobik. Sistem ini berfungsi terima kasih kepada pengangkutan elektron dari bahan penderma seperti NADH⁺ Ke arah menerima bahan, dalam hal ini oksigen.

Ini menghasilkan tenaga (ATP) dan air peroksida, bergantung kepada sistem sitokrom oksidase yang mempunyai mikroorganisma.

Itulah sebabnya bakteria oksidase yang paling positif juga catalase positif, keadaan yang diperlukan untuk menghapuskan hidrogen peroksida yang dihasilkan, kerana bahan ini adalah toksik kepada bakteria.

Sistem Cytocrome Oxidase C terdapat dalam beberapa bakteria aerobik, beberapa pilihan anaerobik, mikroaerophilic yang terhad dan tidak ada anaerobik yang ketat. Yang terakhir difahami, kerana anaerob yang ketat tidak dapat hidup di hadapan oksigen, oleh itu mereka kekurangan sistem oksidase sitokrom.

Prinsip bukti

Dalam ujian ini menggunakan bahan yang bertindak sebagai penerima elektron buatan, menggantikan pribumi dalam rantai pengangkutan elektron.

Terutamanya pewarna seperti paraphenylendiamine dan indophenol digunakan, yang bertindak sebagai substrat reseptor dan penderma elektron buatan.

Paraphenyndiamine dioksidakan oleh sistem cytocrome oxidase c. Pewarna dalam bentuk yang dikurangkannya tidak berwarna, tetapi dalam bentuk teroksida ia berwarna.

Ini adalah bagaimana kehadiran sistem cytochrome oxidase C C; Nah, tindak balas positif akan menghasilkan lavender atau warna biru -púrpura bergantung pada reagen yang digunakan.

Boleh melayani anda: paleobiologi: sejarah, kepakaran, penemuan

Sebaliknya, jika bahan penerima elektron terakhir dalam rantaian pernafasan adalah berbeza daripada oksigen, ujian oksidase akan memberi negatif (tidak ada pengeluaran warna); Inilah kes mikroorganisma anaerob.

Begitu juga, jika cytochrome yang digunakan oleh mikroorganisma berbeza dari cytochrome oxidase c, ia juga akan memberikan ujian negatif.

Prosedur

Untuk ujian oksidase terdapat beberapa reagen dan protokol, semuanya dengan tujuan yang sama.

Reagen

Kovacs Reactive, Gordon dan McLeod Reagent, Reagent Nadi, Reagen Carpenter, Suhrland dan Morrison, dan penggunaan cakera oksidase.

-Reagen Kovacs Oxidase

Ia terdiri daripada tetramethyl-p-phenylendiamine diklorhydrate pada 1%.

Reagen Kovacs disediakan dengan membubarkan 1 gr bahan yang disebutkan dalam 50 ml air suling. Ia dipanaskan secara halus sehingga jumlah penyelesaiannya. Pindahkan ke sebotol kapasiti yang mencukupi dan lengkapkan kelantangan pada 100 ml dengan air suling. Tunggu sekurang -kurangnya 15 minit sebelum menggunakan. Simpan di dalam peti sejuk yang dilindungi dari cahaya.

Ia diputar sebagai reagen kovacs oxidase, untuk membezakannya dari reagen kovacs yang digunakan untuk mendedahkan ujian indol. Reagen ini adalah yang paling sensitif, kurang toksik tetapi lebih mahal daripada yang lain dari reagen.

Reaksi positif akan menjadi bukti. Reaksi negatif dibuktikan kerana tidak ada perubahan warna di koloni atau memerlukan warna merah jambu yang sedikit. Medium juga boleh menjadi gelap, tetapi itu tidak bermakna tindak balas positif.

Dengan reagen ini, masa tindak balas adalah penting, perubahan warna yang berlaku antara 5 hingga 15 saat dianggap sebagai tindak balas positif.

-Reagen Gordon dan McLeod

Ia terdiri daripada dimetil-p-phenylendiamine diklorhydrate, juga dikenali sebagai n-dimetil-p-phenylendiamine atau p-amynodimethylaniline p-amocorhydrate. Ia disediakan seperti yang diterangkan untuk reagen kovacs oxidase, menggantikan bahan yang terlibat.

Reagen ini sedikit lebih stabil daripada reagen kovacs oxidase, walaupun semua reagen yang mengandungi p-penilendiamine tidak stabil.

Reaksi ini lewat.

-Reagen Nadi

Ia terdiri daripada 1% α-naftol dalam etil alkohol (95% etanol) dan 1% amin-limanylin. Campuran disediakan di bahagian yang sama dan menggunakan alkohol etil mutlak sebagai dilemahkan, sehingga jumlah yang mencukupi selesai untuk 100 ml.

-Carpenter Reactive, Suhrland dan Morrison

Ia terdiri daripada 1% p-amynodimethylalanine oxalate. Sediakan dengan cara yang sama dengan yang diterangkan untuk reagen kovacs oxidase, menukar bahan yang sepadan.

Boleh melayani anda: rantaian makanan hutan

Dengan penyelesaian siap, jalur reaktif disediakan seperti berikut: Whatman 6-8 cm nombor 1.

Mereka dibenarkan kering tanpa bersentuhan dengan logam, simpan benang balang dengan pengering dan menyimpan di dalam peti sejuk. Jalur ini stabil sehingga 6 bulan.

Ia adalah reagen yang paling stabil dari semua yang disebutkan, dapat bertahan dalam penyelesaian sehingga 6 bulan. Titik lain yang memihak adalah bahawa medium tidak mewarnai di sekitar koloni, jika ia digunakan langsung di atas pinggan.

Penampilan warna merah ditafsirkan sebagai ujian positif.

-Cakera oksidase

Mereka adalah cakera komersial yang diresapi dengan reagen untuk ujian oksidase. Terdapat beberapa jenama komersial di pasaran.

Penggunaannya agak praktikal, kerana kita tidak boleh menyediakan reagen segar, yang memudahkan kerja. Keputusan yang diperoleh boleh dipercayai selagi cakera dipelihara dengan betul.

Protokol

Kaedah plat langsung, kaedah tidak langsung di atas kertas dan penggunaan cakera yang diresapi dengan reagen oksidase.

-Kaedah plat langsung

2 atau 3 titisan mana -mana reagen yang disebutkan di atas ditambah untuk tujuan ini secara langsung di koloni (s) yang terkandung dalam plat sederhana budaya yang tidak mengandungi glukosa.

Perubahan atau tidak warna koloni ditafsirkan, bukan medium. Masa tindak balas yang sah bergantung pada reagen yang digunakan.

-Kaedah tidak langsung di atas kertas

Potong sekeping kertas penapis (Whatman n ° 1) ke saiz 6 cm² Dan ia diletakkan di dalam petri kosong.

Tambah 2 atau 3 titisan reagen Kovacs Oxidase di atas kertas, ambil bahagian dalam koloni yang anda ingin belajar dengan pemegang platinum atau kayu kayu dan lanjutkannya dalam garis lurus pada kertas reagen yang diresapi. Tafsirkan dalam tempoh 5 hingga 10 saat.

Dengan jalur yang disediakan dengan tukang kayu, Suhrland dan Morrison reagen koloni meluas di jalur kering. Jalur yang sama berfungsi untuk mencuba beberapa strain. Tafsirkan pada 10 saat.

-Cakera (metod langsung)

Cakera komersial dengan halus dengan air sulingan steril dan mengatasi koloni untuk belajar. Adalah disyorkan untuk menggunakan plat pada suhu 35 ° C, jika plat digunakan pada suhu bilik atau plat yang disejukkan, reaksi sedikit lebih perlahan. Mentafsirkan perubahan warna antara 10 hingga 20 saat.

Koloni yang terkandung dalam darah atau coklat boleh digunakan.

-Cakera (kaedah tidak langsung)

Lembap album seperti yang diterangkan di atas. Letakkan di petri kosong. Ambil jumlah koloni yang mencukupi untuk belajar dengan pemegang platinum atau kayu kayu dan letakkan di cakera. Mentafsirkan perubahan warna antara 10 hingga 20 saat.

Gunakan

Genus Neisseria dan Acinetobacter kadang -kadang menyerupai banyak morfologi kerana walaupun genre acinetobacter adalah bacillus negatif gram, kadang -kadang ia boleh mengamalkan bentuk cocoid dan mengedarkan secara berpasangan, mensimulasikan genus Neisseria.

Boleh melayani anda: limnologi

Dalam hal ini ujian oksidase sangat berguna. Neisseria jantina adalah acinetobacter positif dan negatif.

Walau bagaimanapun, genus Moraxella sangat mirip dengan genus Neisseria dan kedua -duanya memberikan reaksi positif; Itulah sebabnya kita sentiasa perlu menjalankan ujian penapaian karbohidrat untuk pengenalan muktamad.

Sebaliknya, ujian oksidase berguna untuk membezakan bakteria yang dimiliki oleh keluarga Enterobacteriaceae (semua oksidase negatif) fermers lain, seperti genus pasturel, aeromon, plesiomonas (positif oksidase).

Genus Vibrio dan Helicobacter juga positif oksidase.

QA

Gunakan strain yang diketahui Escherichia coli sebagai kawalan negatif dan strain Pseudomonas aeruginosa sebagai kawalan positif.

Batasan

-Reagen mesti digunakan baru disediakan, kehidupan berguna mereka dalam suhu bilik adalah pendek kerana sangat tidak stabil. Dihidupkan boleh bertahan antara 5 hari hingga 2 minggu.

-Reagen tidak berwarna, jika mereka menukar warna, mereka mesti dibuang. Cakera yang rosak jelas kerana mereka menjadi gelap dari masa ke masa.

-Reaksi positif dengan reagen oksidase Kovacs antara 15 -60 saat dianggap sebagai tindak balas yang tertunda dan selepas 60 saat ia harus dianggap sebagai negatif.

-Dia Haemophylus influenzae Ia memberikan tindak balas oksidase negatif jika mana-mana reagen dengan dimetil-p-phenylendiamine digunakan, tetapi positif jika reagen oksidase kovacs (tetramethyl-p-phenylendiamine) digunakan berguna).

-Media yang mengandungi glukosa mengganggu ujian, palsu negatif.

-Strain Bordetella pertussis Mereka boleh memberikan tindak balas positif yang positif jika mereka datang dari plat agar darah yang sangat pekat.

-Penggunaan pemegang logam (besi) memberikan tindak balas positif yang palsu.

cadangan

-Kerana reagen sangat tidak stabil dan cenderung untuk keluar sendiri.

-Satu lagi cara untuk menangguhkan diri sendiri dari reagen adalah untuk menambah 0.1% asid askorbik pada masa penyediaan reagen.

-Oleh kerana reagen tidak stabil, disyorkan untuk melaksanakan kawalan kualiti mingguan.

-Reagen yang tidak lulus ujian kawalan kualiti tidak boleh digunakan.

Rujukan

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis mikrobiologi. Edisi ke -5. Pan -American Editorial S.Ke. Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosis Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 ed. Pan -American Editorial S.Ke. Argentina.
3. "Ujian Oxidase." Wikipedia, ensiklopedia percuma. Jan 2018, 10:32 UTC. Apr 2019, 14:03
4. Pertubuhan Kesihatan Dunia. Manual makmal untuk mengenal pasti dan menguji kerentanan terhadap antimikroba patogen bakteria yang penting untuk kesihatan awam di dunia pembangunan.2004. Terdapat di: siapa.Int/drugresistance/infosharing
5. Jalur reaktif untuk diagnosis aktiviti oksidase dalam bakteria. Cuba Rev. 2000; 52 (2): 150-151.