Biologi

Pewarnaan spora

Pewarnaan spora
Pewarnaan Spora oleh Kaedah Shaeffer-Fulton atau Wirtz-Conklin. Sumber: Y Juga (Uploader Asal) [GFDL (http: // www.gnu.Org/copyleft/fdl.html) atau cc-be-sa-3.0, Wikimedia Commons

Apakah pewarnaan spora?

The Pewarnaan spora Ini adalah metodologi yang digunakan untuk mewarnai struktur rintangan yang membentuk beberapa genera bakteria ketika mereka berada dalam keadaan yang tidak menguntungkan. Ia berfungsi untuk mengenal pasti bakteria.

Terdapat banyak genre yang membentuk spora, bagaimanapun, yang utama adalah Bacillus dan Clostridium. Genre ini dianggap lebih relevan kerana mereka mempunyai spesies patogen untuk manusia.

Setiap bacillus dapat menimbulkan spora. Pada masa pencelupan penyediaan, spora boleh didapati di dalam bacillus (endospora) atau di luar ini (exospora). Dengan teknik pewarnaan konvensional untuk bakteria - seperti pewarnaan gram - spora tidak berwarna.

Pada masa ini terdapat beberapa metodologi pewarnaan yang mampu menyeberangi struktur tebal spora untuk mencelupkannya. Metodologi ini sangat bervariasi, dan teknik Dorner, pewarnaan Möeller dan metodologi Shaeffer-Fulton, juga dikenali sebagai Wirtz-Conklin boleh disebutkan.

Dari semua teknik yang disebutkan, metodologi Shaeffer-Fulton adalah yang paling banyak digunakan di makmal rutin. Berhutang namanya kepada dua ahli mikrobiologi yang mencipta warna pada tahun 1930: Alicia Shaeffer dan MacDonald Fulton. Walau bagaimanapun, kadang-kadang teknik itu dipanggil Wirtz-Conklin untuk menghormati dua ahli bakteriologi 1900.

Asas

Spora tidak dicelup dengan warna konvensional kerana mereka mempunyai dinding yang sangat tebal. Komposisi kompleks spora menghalang kemasukan kebanyakan pewarna.

Sekiranya spora di luar dikaji ke dalam, lapisan berikut diperhatikan: Pertama, terdapat exosporium, yang merupakan lapisan terbaik dan paling luaran yang dibentuk oleh glikoprotein.

Kemudian datang kutikula, yang memberikan ketahanan terhadap suhu tinggi, diikuti oleh korteks yang terdiri daripada peptidoglycan. Seterusnya, terdapat pangkalan pangkalan yang melindungi protoplas.

Spora adalah struktur kering yang mengandungi 15% kalsium dan asid dipycolin. Oleh itu, kebanyakan teknik pewarna spora didasarkan pada aplikasi haba supaya pewarna dapat menembusi struktur tebal.

Boleh melayani anda: lactogenesis: ciri dan peringkat

Setelah spora bernoda, ia tidak dapat menghilangkan pewarna. Dalam teknik Shaeffer-Fulton, hijau Malachite memasuki sel-sel vegetatif dan, dengan menggunakan haba, menembusi endospora.

Semasa mencuci dengan air, pewarna dikeluarkan dari sel vegetatif. Ini berlaku kerana pewarna hijau malachite sedikit asas, jadi sel vegetatif mengikat lemah.

Sebaliknya, anda tidak boleh keluar dari spora dan akhirnya bacillus dengan safranine disewa. Asas ini sah untuk keseluruhan teknik, di mana sesuatu yang serupa berlaku.

Teknik pewarna spora

Untuk melakukan pewarnaan spora, anda mesti mempunyai tanaman murni ketegangan yang mencurigakan yang ingin anda pelajari.

Tanaman ini tertakluk kepada suhu yang melampau selama 24 jam untuk merangsang mikroorganisma ke sporular. Untuk ini, tanaman boleh diletakkan di 44 ° C atau di dalam peti sejuk (8 ° C) selama 24 atau 48 jam.

Sekiranya anda meninggalkan terlalu lama pada suhu yang disebutkan di atas, hanya exospaurs akan diperhatikan, kerana semua endospores akan meninggalkan bacillus.

Masa berpuncak, beberapa tetes penyelesaian fisiologi steril pada slaid bersih harus diletakkan. Kemudian sebahagian kecil tanaman diambil dan halus dilanjutkan. 

Selepas itu, ia dibenarkan kering, ia ditetapkan dalam haba dan pewarna dengan beberapa teknik yang dijelaskan di bawah:

Teknik Dorner

  • Sediakan dalam tiub ujian Penggantungan pekat mikroorganisma yang sporulasi dalam air suling dan tambahkan jumlah yang sama Fenicada Fuchsina Kinyoun ditapis.
  • Letakkan tiub dalam mandi dengan air mendidih selama 5 dan 10 minit.
  • Pada slaid bersih bercampur setitik penggantungan sebelumnya dengan setitik larutan nigrosin berair pada 10%, direbus dan ditapis.
  • Memanjangkan dan kering dengan api lembut.
  • Periksa dengan sasaran 100x (rendaman).

Spora dicelup sel merah dan bakteria kelihatan hampir tidak berwarna dengan latar belakang kelabu gelap.

Boleh melayani anda: Helmintology: asal, kajian apa, contoh penyelidikan

Teknik Dorner yang diubahsuai

  • Salah satu penggantungan mikroorganisma yang sporulasi dibuat pada slaid dan ditetapkan untuk memanaskan.
  • Sampel ditutup dengan jalur kertas penapis yang mana Fenicada Fuchsin ditambah. Pewarna dipanaskan 5 hingga 7 minit dengan api Bunsen lebih ringan sehingga detasmen wap dihasilkan. Maka kertas itu ditarik balik.
  • Penyediaan dengan air dibasuh dan kemudian kering dengan kertas penyerap.
  • Smear ditutup dengan filem nipis 10%nigrosine, menggunakan slaid kedua untuk memanjangkan nigrosine atau jarum.

Pewarnaan yang diambil oleh spora dan bakteria adalah sama dengan yang diterangkan dalam teknik sebelumnya.

Teknik Shaeffer-Fulton atau Wirtz-Conklin

  • Buat denda diperpanjang dengan penggantungan mikroorganisma yang sporulasi pada slaid dan memperbaiki haba.
  • Tutup slaid dengan larutan malachite hijau berair pada 5% (kertas penapis boleh diletakkan di atas lembaran).
  • Panaskan api Bunsen lebih ringan sehingga menyebabkan detasmen wap dan keluarkan api. Ulangi operasi 6 hingga 10 minit. Jika semasa prosedur penyelesaian hijau malachite menguap, lebih banyak boleh ditambah.
  • Keluarkan kertas penapis (jika diletakkan) dan basuh dengan air.
  • Tutup slaid dengan safranin berair 0.5% selama 30 saat (beberapa varian teknik menggunakan 0.1% safranine berair dan biarkan selama 3 minit).

Dengan teknik ini spora dibentangkan hijau dan bacilli merah.

Ia mempunyai kesulitan bahawa endospores tanaman muda tidak dicelup dengan baik, kerana mereka kelihatan sangat jelas atau tidak berwarna. Untuk mengelakkan ini, disarankan untuk menggunakan tanaman inkubasi 48 -hour.

Teknik Möeller

  • Tutup smear dengan kloroform selama 2 minit.
  • Buang kloroform.
  • Tutup dengan 5% asid kromik selama 5 minit.
  • Basuh dengan air suling.
  • Lembaran dengan fuchsin-fenicada carbol dilindungi dan terdedah kepada api bunsen lebih ringan sehingga pelepasan wap, maka ia dikeluarkan dari api beberapa saat. Operasi diulang sehingga 10 minit.
  • Basuh dengan air.
  • Gunakan etanol berasid (alkohol hidroklorik) untuk menghilangkan warna. Ia ditinggalkan selama 20 atau 30 saat.
  • Basuh dengan air suling.
  • Sewa yang menutup lembaran dengan metilena biru selama 5 minit.
  • Basuh dengan air suling.
  • Ia dibenarkan kering dan mengambil sampel ke mikroskop.
Boleh melayani anda: fenomena biologi

Spora kelihatan merah dan bacilli biru. Adalah penting untuk tidak bercita -cita untuk wap, kerana mereka adalah toksik dan jangka panjang mereka boleh menjadi karsinogenik.

Teknik Möeller diubah suai tanpa haba

Pada tahun 2007, Hayama dan kolaboratornya mencipta pengubahsuaian teknik Möeller. Mereka menghapuskan pewarna pewarna dan menggantinya dengan penambahan 2 titik surfaktan Tergitol 7 untuk setiap 10 ml larutan karbohidrat fuchsin. Keputusan yang sama diperoleh.

Aplikasi

Pewarna spora memberikan maklumat yang sangat berharga dan berguna untuk mengenal pasti patogen, kerana kehadiran yang sama, bentuknya, lokasi di dalam bacillus dan keupayaan untuk mengubah bentuk sel vegetatif atau tidak, adalah data yang dapat membimbing spesies di atas spesies yang terlibat dalam jantina tertentu.

Dalam konteks ini, patut dikatakan bahawa spora boleh menjadi bulat atau bujur, mereka boleh terletak di tengah atau juga di kedudukan palicentral, subterminal atau terminal.

Skim bentuk dan kedudukan endospores dan exospore

Contoh

  • Clostridium difficile Ia membentuk spora bujur dalam kedudukan terminal yang mengubah bentuk bacillus.
  • Spora Clostridium Tertium Ia adalah bujur, tidak mengubah bentuk bacillus dan terletak di peringkat terminal.
  • Endospora of Clostridium Tetani Ia adalah terminal dan ubah bentuk bacillus, memberikan kemunculan tongkat gendang.
  • Spora Clostridium botulinum, C. Histolyticum, C. Novy dan C. septikum Mereka bulat atau bujur, bawah tanah dan ubah bentuk bacillus.
  • Endospora of Clostridium Sordelli Ia terletak di kedudukan tengah, dengan sedikit ubah bentuk.

Rujukan

  1. Moeller Stain. Diambil dari.Wikipedia.org.
  2. Endospora. Pulih dari ES.Wikipedia.org.
  3. Forbes, b., Sahm, d., Weissfeld, a. Diagnosis Mikrobiologi Bailey & Scott. Pan -American Editorial S.Ke.