Ciri-ciri, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Ciri-ciri, Yayasan, Penggunaan

Dia DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) Ia adalah pewarna yang oleh harta pendarfluornya berfungsi sebagai penanda, yang digunakan secara meluas dalam teknik mikroskopi pendarfluor atau aliran cytometry, antara lain. Pendarfluor yang dipancarkannya berwarna biru terang, kegembiraannya berlaku antara 455-461 nm (cahaya UV).

Pewarna DAPI dapat menyeberang membran sel dari sel mati dengan mudah. Anda juga boleh mewarnai nukleus sel hidup, tetapi dalam kes ini, kepekatan ini mestilah lebih besar.

Struktur Kimia Dyst Fluorescent. Sumber: Imej: Fail: DAPI.SVG adalah versi vektor fail ini. Ia harus digunakan sebagai pengganti imej raster ini apabila tidak lebih rendah/Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // creativeCommons.Org/lesen/by-sa/3.0/)] gambar yang diedit

Pewarna ini mampu mengakses DNA sel di mana ia mempunyai pertalian khas, bergabung dengan kehebatan yang hebat untuk asas adenine dan timin nitrogen. Atas sebab ini, sangat berguna dalam beberapa teknik biologi molekul.

Kompaun ini tergolong dalam kumpulan pewarna indolic dan telah menunjukkan kepekaan yang lebih besar terhadap DNA daripada etidium bromida dan iodida yang mengasyikkan, terutamanya mengenai gel agarose.

Penggunaan pewarna pendarfluor ini sangat luas, kerana ia berguna untuk: mengkaji perubahan dalam DNA dalam proses apoptotik (kematian sel) dan oleh itu mengesan sel dalam proses ini; untuk foto jejak DNA (percetakan fotografi DNA); untuk mengkaji pencemaran bakteria; o Untuk menggambarkan segmentasi nuklear.

Ia juga telah digunakan dalam kajian band kromosom, dalam pengesanan DNA Mycoplasmas sp, Dalam interaksi DNA-protein, dalam pewarnaan dan pengiraan sel oleh immunofluorescence dan juga mewarna bijirin debunga matang.

[TOC]

Ciri -ciri

DAPI adalah singkatan nama kimianya (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol). Formula molekulnya adalah c₁₆H_{lima belas}N_5. Ia mempunyai berat molekul 350.3. Berhampiran julat cahaya UV (345 hingga 358 nm) Pengujaan maksimum kompleks tambah dapi berlaku, sementara pelepasan pendarfluor maksimum berlaku antara 455-461 nm.

Pewarna ini dicirikan dengan menjadi debu kuning, tetapi struktur yang ditandai dengan fluorophore ini memancarkan cahaya biru terang.

Ia adalah sebatian larut air, bagaimanapun, untuk mempercepatkan pembubarannya, beberapa haba boleh digunakan. Ia boleh dicairkan dengan PBS tetapi tidak membubarkan terus ke dalam ini.

Ia boleh melayani anda: Asid Arsenioso (H3SO3): sifat, risiko dan kegunaan

Setelah pewarna telah disediakan, ia mesti disimpan dalam kegelapan, iaitu, dilindungi dari cahaya, pada suhu 2 hingga 8 ° C (peti sejuk). Di bawah syarat -syarat ini, pewarna stabil selama lebih dari 3 minggu atau bulan.

Sekiranya cahaya dilindungi tetapi kestabilannya ditinggalkan pada suhu bilik hingga 2 atau 3 minggu, tetapi terdedah kepada cahaya langsung kemerosotan sangat cepat. Sekiranya anda ingin menjimatkan lebih lama, anda boleh menyejukkan pada -20 ° C yang diedarkan dalam aliquot.

Asas

Pewarnaan ini didasarkan pada menghasilkan pengambilan nuklear dalam teknik utama biologi molekul, seperti: sitometri aliran, mikroskopi pendarfluor dan pewarnaan kromosom metaphasic atau nukleus antara muka, antara lain.

Teknik ini didasarkan pada pertalian besar bahawa pewarna mempunyai asas nitrogen (adenine dan timin) yang terkandung dalam bahan genetik (DNA) di alur kecil. Semasa berada di tahap sitoplasma meninggalkan bahagian bawah yang sangat sedikit.

Apabila kesatuan pewarna pendarfluor ke kawasan adenine dan timina DNA berlaku, pendarfluor meningkat dengan ketara (20 kali lebih banyak). Warna yang dipancarkannya berwarna biru terang. Harus diingat bahawa tidak ada pelepasan pendarfluor ketika mengikat pasangan asas GC (guanina-citosin).

Adalah penting untuk menyerlahkan bahawa walaupun ia juga mempunyai pertalian untuk RNA, ia tidak menyebabkan masalah, kerana tahap pelepasan tenaga molekul ini berlaku kepada panjang gelombang lain (500 nm), tidak seperti DNA yang melakukannya hingga 460 nm. Di samping itu peningkatan pendarfluor sekali dikaitkan dengan RNA hanya 20%.

DAPI digunakan lebih banyak untuk pewarna mati (tetap) sel yang anda hidup, kerana untuk mewarnai yang terakhir kepekatan pewarna yang lebih tinggi diperlukan, ini kerana membran sel jauh lebih telap ke DAPI ketika masih hidup.

Pewarna DAPI boleh digunakan dalam kombinasi dengan fluorophores merah dan hijau untuk mendapatkan pengalaman berwarna -warni.

Gunakan

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) adalah fluorophore yang sangat baik dan oleh itu digunakan secara meluas dalam pelbagai teknik dan untuk pelbagai tujuan. Penggunaan DAPI dijelaskan di bawah dalam teknik utama.

Aliran cytometry

Para penyelidik Gohde, Schumann dan Zante pada tahun 1978 adalah yang pertama menggunakan dan mencadangkan DAPI sebagai fluorophore dalam teknik aliran sitometri, yang berjaya kerana sensitiviti tinggi mereka oleh DNA dan intensiti tinggi dalam pelepasan pendarfluor.

Ia boleh melayani anda: kumpulan amino (NH2): struktur, sifat, contoh

Penggunaan DAPI dalam teknik ini, membolehkan kajian kitaran sel, kuantifikasi sel dan pewarnaan sel hidup dan mati.

Walaupun terdapat pewarna lain, seperti etidium bromida, hoechst oxide, acridine oren dan propidio iodide, dapi adalah salah satu yang paling banyak digunakan untuk menjadi lebih banyak foto daripada yang disebutkan di atas.

Untuk teknik ini, ia perlu. Sampel disentrifugasi dan supernatan dibuang.

Sementara masa melewati pewarna dapi dengan penampan pewarnaan (Foxp3 biolegend) hingga 3 μm.

Centrifugue sampel, buang supernatan dan kemudian tutup dengan 1 ml larutan DAPI selama 15 minit pada suhu bilik.

Ambil sampel ke cytometer aliran dengan laser yang betul.

Mikrofluorometri aliran

Teknik lain di mana DAPI digunakan adalah dalam aliran mikro-fluorometri bersama dengan fluorophore lain yang disebut mitramikal. Kedua -duanya berguna untuk mengukur.

Hibridisasi In situ 

Teknik ini pada dasarnya menggunakan probe DNA yang ditandai dengan pewarna pendarfluor yang boleh menjadi DAPI.

Sampel memerlukan dirawat dengan haba untuk menafikan DNA dua kelas dan menjadikannya dua rantai monokypenary. Selepas itu, ia hibridisasi dengan siasatan DNA DNA yang ditandai dengan DAPI yang mempunyai urutan minat.

Seterusnya, ia dibasuh untuk menghapuskan apa yang tidak hibrid, kontras digunakan untuk menggambarkan DNA. Mikroskop pendarfluor membolehkan pemerhatian probe hibrid.

Teknik ini bertujuan untuk mengesan urutan tertentu dalam DNA kromosom, dapat mendiagnosis penyakit tertentu.

Teknik-teknik molekul ini telah membantu menentukan butiran dalam kajian karyotypes. Sebagai contoh, ia telah membuktikan kawasan yang kaya dengan pasangan asas adenosin dan timin yang dipanggil kawasan heterochromatic atau band DAPI.

Boleh melayani anda: kebolehtelapan: konsep, unit, faktor, contoh

Teknik ini digunakan secara meluas untuk mengkaji kromosom dan kromatin dalam tumbuhan dan haiwan, serta dalam diagnosis patologi pranatal dan hematologi dalam manusia.

Dalam teknik ini, kepekatan DAPI yang disyorkan ialah 150 ng/ml untuk masa 15 minit.

Slaid yang sudah dipasang harus dilindungi dari cahaya pada 2-8 ° C.

Pewarnaan immunofluorescence

Sel -sel ditetapkan dengan 4% paraformaldehyde. Sekiranya pewarna lain akan digunakan, DAPI ditinggalkan pada akhir sebagai pengambilan dan sel -sel dengan penyelesaian PBS selama 15 minit ditutup. Semasa masa berlalu, sediakan penyelesaian DAPI yang dicairkan dengan PBS, supaya kepekatan akhir adalah 300 μm.

Kemudian PBS berlebihan diekstrak dan ditutup dengan DAPI selama 5 minit. Basuh beberapa kali. Lembaran diperhatikan dalam mikroskop pendarfluor di bawah penapis yang betul.

Lembaran keselamatan

Sebatian ini mesti dimanipulasi dengan teliti, kerana ia adalah sebatian yang mempunyai sifat mutagenik. Karbon diaktifkan digunakan untuk menghapuskan sebatian penyelesaian berair yang akan dibuang.

Sarung tangan, jubah dan kanta keselamatan harus digunakan untuk mengelakkan kemalangan dengan reagen ini. Sekiranya kenalan atau hubungan mukus berlaku, anda harus mencuci kawasan dengan air yang mencukupi.

Anda tidak boleh mengetuk mengenai reagen ini dengan mulut anda, gunakan proipet.

Jangan mencemarkan reagen dengan ejen mikrob, kerana ini akan mengakibatkan hasil yang salah.

Jangan cairkan pewarna DAPI lebih daripada disyorkan, kerana kualiti pewarnaan akan berkurang.

Jangan dedahkan reagen untuk mengarahkan cahaya, atau teruskan haba kerana ia mengurangkan pendarfluor.

Rujukan

1. Brammer S, Toniazzo C dan Poersch L. Cytogenetics sayur -sayuran yang usahawan. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Terdapat dari: Scielo.
2. Makmal impath. DAPI. Terdapat di: menarinidiagnostik.com/
3. Makmal Cytocell. 2019. Arahan untuk menggunakan DAPI. Terdapat di Cycell.com
4. Elaosegi A, Sabater S. Konsep dan teknik dalam ekologi sungai. (2009). Rubes Editorial, Sepanyol. Terdapat di: Buku.Google.co.pergi/
5. Novaes R, Penitent A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Penggunaan pendarfluor dalam kaedah dissector yang diubahsuai untuk menganggarkan bilangan myocytes dalam tisu jantung. Arq. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Terdapat dari: Scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Kehadiran fitoplasma di papayo (Carica papaya) di Mexico. Majalah Chapingo. Siri Hortikultur, 2011; 17 (1), 47-50. Terdapat di: Scielo.org.