Yayasan, Protokol dan Aplikasi Immunofluorescence

The Immunofluorescence Ini adalah teknik immunomarcy yang kuat yang menggunakan antibodi bersatu kovalen ke molekul pendarfluor untuk mengenal pasti sasaran tertentu dalam sampel sel yang ditetapkan pada sokongan kukuh.

Teknik ini pemerhatian mikroskopik dengan kekhususan imun, memungkinkan pemerhatian hidup atau sel mati yang mungkin mempunyai sedikit antigen. Ia digunakan secara meluas dalam bidang penyelidikan dan dalam diagnosis klinikal pelbagai patologi.

Immunomariness filamen actin dalam sel kardiomiosit (Sumber: PS1415 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/lesen/by-sa/4.0)] melalui Wikimedia Commons)

Teknik terutamanya kualitatif ini (dengan beberapa varian kuantitatif), perlu dilakukan secara khusus dengan visualisasi sampel dengan produk fluorophore, yang merupakan molekul pendarfluor yang dilampirkan pada antibodi dan yang mampu menarik diri mereka pada panjang gelombang tertentu.

Dalam konteks sel, sangat berguna untuk mengkaji kehadiran/ketiadaan dan lokasi protein subselular. Teknik ini digunakan dalam permulaannya dalam bidang klinikal untuk diagnosis virus seperti influenza dan seterusnya untuk banyak penyakit berjangkit lain.

Ini adalah teknik kepekaan yang hebat, dan dengan pasukan mikroskopi yang betul, ia boleh mempunyai resolusi yang sangat baik. Ia memerlukan, untuk pemerhatiannya, penggunaan mikroskop confocal atau epifluorescence.

Walau bagaimanapun, walaupun sangat popular, anda boleh mengemukakan beberapa masalah penting mengenai mendapatkan pendarfluor yang tidak spesifik yang menghasilkan "bunyi" tertentu di latar belakang, yang sering membatasi bacaan yang betul dari hasilnya.

[TOC]

Asas

Immunofluorescence didasarkan pada eksploitasi fenomena biologi tindak balas interaksi antara antibodi dan antigen. Ia harus dilakukan secara khusus dengan visualisasi atau pengesanan tindak balas ini apabila molekul pendarfluor yang menarik pada panjang gelombang tertentu.

Antibodi adalah protein immunoglobulin yang dirembeskan dari sel B aktif, dan secara khusus dihasilkan terhadap antigen, yang dapat disertai dengan pertalian dan kekhususan yang besar. Immunofluorescence menggunakan immunoglobulin IgG, yang didapati larut dalam serum darah.

Antibodi adalah molekul sehingga 950 kDa terdiri daripada dua peptida pendek (cahaya) dan dua panjang dalam bentuk "y" (berat). Kedua -dua rantai ringan dan berat dibahagikan kepada dua domain: satu pembolehubah, mampu mengenali antigen, dan ciri -ciri lain yang tetap atau dipelihara,.

Antigen ditakrifkan secara fungsional sebagai molekul yang boleh diiktiraf oleh antibodi dan kebanyakannya protein. Apabila haiwan terdedah kepada antigen, limfosit sistem imun diaktifkan, menghasilkan antibodi tertentu terhadapnya dan berfungsi sebagai sistem pertahanan.

Sebagai contoh, antigen, seperti protein, misalnya, boleh mempunyai lebih daripada satu epitope atau tempat pengiktirafan untuk antibodi, jadi serum haiwan yang terdedah kepada antigen boleh mempunyai antibodi poliklonal terhadap kawasan yang berbeza dari protein yang sama.

Ia dapat melayani anda: epidermis bawang

Immunofluorescence, kemudian, mengeksploitasi keupayaan haiwan untuk menghasilkan antibodi poliklonal terhadap antigen tertentu untuk membersihkannya dan kemudian menggunakannya untuk mengesan antigen yang sama dalam konteks lain.

Antara pewarna atau molekul pendarfluor yang paling banyak digunakan untuk beberapa teknik immunofluorescence adalah fluorescein isootiocyanate (FITC), tetramethylrodamine-5 dan 6 (TRITC) isochianate, banyak sianin seperti Cy2, Cy3 dan cy7 yang dipanggil Alexa Fluor®448.

Protokol

Protokol immunofluorescence berbeza -beza bergantung kepada banyak faktor, bagaimanapun, dan secara umum, merangkumi urutan linear langkah -langkah yang terdiri daripada:

• Penyediaan lembaran dan sel
• Penetapan sampel
• Permeabilisasi
• Menyekat
• Imunotif atau immunomarcaje
• Perhimpunan dan pemerhatian

-Penyediaan

Sampel

Penyediaan sampel bergantung kepada sifat mereka dan jenis pengalaman yang akan dijalankan. Seterusnya, kes paling mudah akan dijelaskan, yang membayangkan penggunaan sel yang digantung.

Sel penggantungan, iaitu, dalam medium kultur cecair, mesti terlebih dahulu dipisahkan dari ini dengan sentrifugasi dan kemudian harus dibasuh dengan penyelesaian penampan atau "Penampan " isosmotik, yang mengekalkan integritinya.

Biasanya penampan fosfat-salin digunakan dikenali sebagai PBS, di mana sel-sel tersebut ditelan semula.

Dari lembaran

Lembaran yang digunakan untuk pemerhatian mikroskopik, di mana sel -sel akan ditetapkan untuk rawatan hiliran yang sepadan, juga mesti disediakan dengan teliti.

Ini dilindungi atau "sensitif" dengan larutan polysine, polimer sintetik yang akan berfungsi sebagai "gam molekul" antara sel dan sokongan pepejal, terima kasih kepada interaksi elektrostatik antara caj positif kumpulan amino mereka dan beban negatif protein yang menutup sel.

Penetapan sampel

Proses ini terdiri daripada tidak bergerak protein yang berada di pedalaman selular untuk memastikan lokasi spatial mereka utuh. Molekul yang digunakan harus dapat menyeberangi semua jenis membran sel dan membentuk bingkai dengan protein kovalen.

Formaldehid dan paraformaldehid, glutaraldehid dan juga metanol digunakan secara meluas, dengan sampel sel yang diinkubasi untuk masa tertentu dan kemudian membasuhnya dengan penyelesaian penampan isosmotik.

Selepas penetapan sel, ia terus menyertai mereka ke lembaran yang terdahulu dengan polysine.

Permeabilisasi

Bergantung pada jenis ujian yang dilakukan, ia perlu untuk menyerap atau tidak sel -sel yang sedang dikaji. Sekiranya apa yang dicari adalah mengetahui lokasi, kehadiran atau ketiadaan, protein tertentu di permukaan sel, permeabilisasi tidak perlu.

Boleh melayani anda: Phosphatidylinositol: Struktur, Latihan, Fungsi

Sebaliknya, jika anda ingin mengetahui lokasi protein di dalam selular selular, permeabilisasi sangat diperlukan dan akan terdiri daripada sampel yang mengeram dengan Triton X-100, detergen yang mampu membran sel permeabilizing.

Menyekat

Langkah asas dalam semua teknik imunologi adalah menyekat. Pada tahap prosedur ini, sekatan terdiri daripada penutup, dalam lembaran yang sensitif, semua tapak dengan molekul poliesin yang mana sel tidak dipatuhi. Iaitu, ia menghalang kesatuan tidak spesifik.

Biasanya untuk menyekat penyelesaian dengan albumin whey bovine (BSA) digunakan dalam penampan PBS dan hasil terbaik diperoleh lebih lama ia adalah masa inkubasi dengan penyelesaian ini. Selepas setiap langkah, termasuk sekatan, perlu mengeluarkan penyelesaian yang selebihnya dengan mencuci.

Imunotif atau immunomarcaje

Prosedur imunomariness atau imunomariness bergantung terutamanya jika ia adalah immunofluorescence langsung atau tidak langsung (lihat kemudian).

Jika ia adalah immunofluorescence utama atau langsung, sampel akan diinkubasi dengan antibodi yang dikehendaki, yang mesti ditambah dengan pewarna pendarfluor. Prosedur inkubasi terdiri daripada membuat pencairan antibodi dalam penyelesaian yang BSA juga akan mengandungi tetapi dalam perkadaran yang lebih rendah.

Apabila kes itu adalah immunofluorescence sekunder atau tidak langsung, dua inkubasi berturut -turut mesti dibuat. Pertama dengan antibodi yang dikehendaki dan kemudian dengan antibodi yang dapat mengesan kawasan malar imunoglobulin utama. Ini adalah antibodi sekunder yang bersatu kovalen ke fluorophores.

Teknik ini sangat serba boleh, membolehkan tanda serentak lebih daripada satu antigen setiap sampel, selagi mereka mempunyai antibodi utama ditambah dengan fluorophores yang berbeza, dalam hal immunofluorescence langsung.

Untuk tanda serentak dalam immunofluorescence tidak langsung, ia perlu.

Seperti sekatan, inkubasi dengan antibodi memberikan hasil yang lebih baik semakin besar masa ini. Selepas setiap langkah, perlu mencuci antibodi yang berlebihan yang tidak menyertai sampel dan dalam immunofluorescence sekunder, perlu disekat sebelum menambahkan antibodi sekunder.

Teknik tertentu menggunakan pewarna lain yang tidak ada kaitan dengan imunomariness, seperti pewarnaan DNA nuklear dengan fluorophore DAPI.

Perhimpunan dan pemerhatian

Semasa masa inkubasi akhir dengan fluorophores, adalah perlu bahawa sampel kekal dalam kegelapan. Untuk pemerhatian mikroskop, ia adalah perkara biasa.

Lelaki

Ringkasan grafik immunofluorescence langsung dan tidak langsung (Sumber: Westhayl618 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/lesen/by-sa/4.0)] melalui Wikimedia Commons)

Immunofluorescence langsung atau utama

Ia mempunyai kaitan dengan pengesanan antigen melalui penggunaan antibodi pendarfluor. Kelebihan utama penggunaan teknik ini adalah kelajuannya, bagaimanapun, banyak kes kesatuan tidak spesifik dapat terjadi dalam proses, terutama ketika mempelajari sera manusia, karena mereka kaya dengan antibodi yang sangat heterogen.

Boleh melayani anda: 5 cabang bioteknologi utama

Immunofluorescence tidak langsung atau sekunder

Ia juga dikenali sebagai teknik "sandwic" dan ini menunjukkan perkembangan teknik dalam dua langkah. Yang pertama ada kaitan dengan penggunaan antibodi yang tidak berpengalaman dan kesatuannya kepada antigen yang menarik.

Terhadap rantau berterusan antibodi pertama ini (yang kini akan berfungsi sebagai antigen) antibodi kedua yang mampu mengenalinya digunakan, yang dikaitkan dengan molekul pendarfluor.

Kemunculan isyarat pendarfluor akan menjadi hasil pengiktirafan khusus antara antibodi bukan fluorescent pertama dan antigen kepentingan; Kehadiran syarat antibodi pertama yang kedua, yang dilabelkan dan terima kasih di mana kehadiran atau ketiadaan antigen dapat ditentukan.

Walaupun menjadi teknik yang menggunakan lebih lama daripada immunofluorescence langsung (kerana ia termasuk langkah inkubasi yang lebih), teknik ini tidak membayangkan reka bentuk antibodi pendarfluor bagi setiap antigen yang dikaji, yang hasilnya, dari segi ekonomi, lebih berdaya maju.

Di samping itu, ia adalah teknik yang lebih sensitif dari segi penguatan isyarat, kerana lebih daripada satu antibodi sekunder dapat bergabung.

Aplikasi

Seperti yang diperhatikan sebelum ini, immunofluorescence adalah teknik yang sangat serba boleh, yang mana banyak kegunaan dalam bidang saintifik dan klinikal telah diberikan. Ia boleh digunakan untuk menjawab soalan ekologi, genetik dan fisiologi mengenai banyak organisma.

Antara aplikasi klinikal, ia digunakan untuk diagnosis langsung beberapa penyakit dermatologi, sama ada menggunakan immunofluorescence langsung atau tidak langsung pada tisu epitel pesakit yang dikaji.

Teknik immunofluorescence telah diatur dalam organisma uniselular seperti ragi untuk memvisualisasikan microtubules intranuklear dan sitoplasma, actin dan protein yang berkaitan, filamen 10nm dan lain -lain konstituen sitoplasma, membran dan sel sel lain.

Rujukan

1. Abcam, Immunocytochemistry dan Protokol Immunofluorescence. Diperolehi daripada Abcam.com
2. Greph, c. (2012). Pewarna pendarfluor. Diperolehi daripada Leica-Microsystems.com
3. Miller, d. M., & Shakest, d. C. (Sembilan-belas sembilan puluh lima). Mikroskopi immunofluorescence. Dalam Kaedah dalam Biologi Sel (Vol. 48, ms. 365-394). Akademik Press, Inc.
4. Odell, i. D., & Masak, D. (2013). Teknik immunofluorescence. Jurnal Dermatologi Penyiasatan, 133, 1-4.
5. Putera, b. J. R., Adams, a. Dan. M., Druain, d. G., & Brian, k. (1991). Kaedah immunofluorescence untuk ye. Dalam Kaedah enzimologi (Vol. 194, ms. 565-602). Akademik Press, Inc.
6. Schaeffer, m., Orsi, e. V, & widelock, d. (1964). Aplikasi imunoflorensi dalam virologi kesihatan awam. Ulasan Bacteriological, 28(4), 402-408.
7. Vrieling, e. G., & Anderson, D. M. (Sembilan belas sembilan puluh enam). Immunofluorescence dalam Penyelidikan Phytoplankton: Aplikasi dan Potensi. J: Phycol., 32, 1-16.